Single cell resolution 3D imaging and segmentation within intact live tissues

要約

上皮細胞は、扁平上皮球体オルガノイドから密に詰め込まれた偽分散組織まで、多様な構造を形成します。
これらのコンテキストでの細胞特性の定量化には、真実の3次元（3D）構造的特徴を達成するために、高解像度の深いイメージングと計算技術が必要です。
ここでは、サンプル調製、イメージング、および深部学習補助細胞セグメンテーションのための詳細なステップバイステッププロトコルについて説明して、生きた組織内の3Dで蛍光標識された個々の細胞の正確な定量化を実現します。
ショウジョウバエ翼ディスクの3Dイメージングのトラブルシューティングを通じて学んだ教訓を共有します。これには、顕微鏡法のモダリティと設定（目的、サンプルマウント）および利用可能なセグメンテーション方法の選択に関する考慮事項が含まれます。
さらに、プロトコルの複製を支援するために、カスタムコードとともに計算パイプラインを含めます。
膜標識からの細胞の輪郭のセグメンテーションに焦点を当てていますが、このプロトコルはさまざまなサンプルに適用されます。3Dで複雑な分析を必要とする他の組織を研究するためには価値があると考えています。

要約(オリジナル)

Epithelial cells form diverse structures from squamous spherical organoids to densely packed pseudostratified tissues. Quantification of cellular properties in these contexts requires high-resolution deep imaging and computational techniques to achieve truthful three-dimensional (3D) structural features. Here, we describe a detailed step-by-step protocol for sample preparation, imaging and deep-learning-assisted cell segmentation to achieve accurate quantification of fluorescently labelled individual cells in 3D within live tissues. We share the lessons learned through troubleshooting 3D imaging of Drosophila wing discs, including considerations on the choice of microscopy modality and settings (objective, sample mounting) and available segmentation methods. In addition, we include a computational pipeline alongside custom code to assist replication of the protocol. While we focus on the segmentation of cell outlines from membrane labelling, this protocol applies to a wide variety of samples, and we believe it be valuable for studying other tissues that demand complex analysis in 3D.

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